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蘭州大學(xué)范增杰：協(xié)同緩解肌肉力量減退促進(jìn)神經(jīng)再生的仿生海參微針神經(jīng)導(dǎo)管

更新時(shí)間：2024-06-12

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周圍神經(jīng)損傷（Peripheral nerve injury，PNI）是一種常見的外傷性疾病，常由車禍、戰(zhàn)傷、工傷和醫(yī)療事故等引起。PNI的典型臨床表現(xiàn)為受損神經(jīng)所支配的區(qū)域出現(xiàn)感覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙，其嚴(yán)重程度因損傷程度而異。這種疾病給患者帶來(lái)了極大的痛苦與不便，嚴(yán)重影響了他們的生活質(zhì)量；同時(shí)，也給患者與社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

PNI的傳統(tǒng)治療方法可分為手術(shù)治療和非手術(shù)治療兩類。非手術(shù)治療方法包括電刺激、磁刺激、激光光療等，而手術(shù)治療方法包括神經(jīng)縫合術(shù)和神經(jīng)移植術(shù)（包括同種異體移植和自體移植）。其中，自體移植術(shù)因其療效最佳，被認(rèn)為是PNI治療的“金標(biāo)準(zhǔn)"。然而，目前的PNI傳統(tǒng)治療方法仍然存在較大的局限性，主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：自體移植術(shù)所需的供體神經(jīng)來(lái)源有限，且術(shù)后存在潛在的致畸、致癌性等風(fēng)險(xiǎn)；此外，PNI并發(fā)的肌肉力量減退問題也會(huì)進(jìn)一步影響功能恢復(fù)的效果。

針對(duì)以上兩方面，蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院范增杰教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)了一種具有海參仿生特性的微針神經(jīng)導(dǎo)管（MNGCs），用于PNI及其導(dǎo)致的肌肉力量減退的協(xié)同高效治療。該MNGCs是由摩方精密 microArch®S230 （精度：2μm）高精度3D打印設(shè)備加工模具后經(jīng)PDMS翻模制備而成。相關(guān)研究成果以“Sea Cucumber-Inspired Microneedle Nerve Guidance Conduit for Synergistically Inhibiting Muscle Atrophy and Promoting Nerve Regeneration"為題發(fā)表在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《ACS Nano》上。蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院碩士研究生胡策文、劉斌為共同第一作者，蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院范增杰教授和康涅狄格大學(xué)化學(xué)與生物分子工程系孫陸逸教授為共同通訊作者。

海參是一種海生軟體動(dòng)物，體型呈圓筒狀，體表外側(cè)長(zhǎng)有規(guī)則排列的錐形狀疣足，內(nèi)側(cè)則長(zhǎng)有規(guī)則排列的條狀肌肉。海參的體壁柔軟，含有大量的膠原。膠原因具有不對(duì)稱的晶體結(jié)構(gòu)，具有壓電效應(yīng)。受此啟發(fā)，作者根據(jù)海參的生理特性和解剖特征設(shè)計(jì)了MNGCs。

MNGC由聚己內(nèi)酯（PCL），還原氧化石墨烯（rGO）和納米氧化鋅顆粒（ZnO NPs）組成。其中，PCL為MNGCs的基質(zhì)材料，使MNGCs具有良好的柔韌性與生物相容性；rGO和ZnO NPs分別賦予了MNGCs良好的導(dǎo)電性能與壓電性能，使MNGCs能產(chǎn)生并傳導(dǎo)適宜的電刺激（ES）。這是模仿了海參具有產(chǎn)生并傳導(dǎo)生物電的潛力的生理特性。同時(shí)，MNGCs的外側(cè)為微針（MNs）的針尖，內(nèi)側(cè)為微通道；MNs可以刺入神經(jīng)周圍肌肉并傳導(dǎo)ES，而微通道可以引導(dǎo)雪旺細(xì)胞（SCs）定向生長(zhǎng)。這是模仿了海參具有錐形疣足和條帶肌肉的解剖特征。MNGCs植入體內(nèi)后，因形變而實(shí)現(xiàn)力電轉(zhuǎn)換產(chǎn)生ES。在MNGCs的內(nèi)側(cè)，ES與微通道共同使SCs定向高效遷移，促進(jìn)軸突和髓鞘的新生進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)的新生；同時(shí)，在MNGCs的外側(cè)，ES通過MNs向其插入的肌肉中傳導(dǎo)ES，進(jìn)而抑制肌肉力量減退。最終實(shí)現(xiàn)了PNI及其導(dǎo)致的肌肉力量減退的高效協(xié)同治療。

首先制備了具有良好導(dǎo)電性能和壓電性能的復(fù)合材料PG與PZG。MNGCs的基質(zhì)材料——PCL原本是不具有導(dǎo)電性能和壓電性能的材料，向其中添加了rGO（PG）和rGO+ZnO NPs（PZG）后，復(fù)合材料的導(dǎo)電性能明顯提升，也具有了壓電性能。當(dāng)rGO含量為2%時(shí)，其電導(dǎo)率為1.03*10-3S/cm；而當(dāng)ZnO NPs含量為2%時(shí)，其可輸出的電壓和電流的最大值分別為4.6 V和1.9 μA。這一優(yōu)良的電學(xué)特性具有充足的潛力促進(jìn)PNI及肌肉力量減退的協(xié)同治療。又因?yàn)閞GO和ZnO NPs具有潛在的生物毒性，通過MTT法對(duì)其在PCL中的含量進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)當(dāng)rGO和ZnO NPs的含量≤2%，材料仍具有良好的生物相容性（見圖3-A&B）。因此，確定PG與PZG中 rGO和ZnO NPs的含量為2%，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖二. PG與PZG的電學(xué)性能。(A). rGO含量不同時(shí)PG的電阻率。(B). rGO含量不同時(shí)PG的電導(dǎo)率。(C).PZG的PFM振幅圖。(D)和(E). ZnO NPs含量不同時(shí)PZG的開路電壓。(F)和(G). ZnO NPs含量不同時(shí)PZG的短路電流。

研究團(tuán)隊(duì)使用上述PCL，PG與PZG作為材料，通過模板法制備了MNGCs。如圖三所示，藍(lán)色的模板為制備MNs用的PDMS陰模。此PDMS陰模的制備過程如下：先使用摩方精密microArch®S230 3D打印設(shè)備構(gòu)建主MNs，再使用PDMS轉(zhuǎn)寫主MNs以獲得PDMS陰模。材料注入PDMS陰模后，使用摩方精密microArch®S230 3D打印設(shè)備構(gòu)建的黃色模板——塑料微通道模板，此微通道模板是直接由設(shè)備構(gòu)建而來(lái)。MNs基底背側(cè)的微通道構(gòu)建完畢且MNs冷卻后，將其取出并卷成管狀，即可獲得MNGCs。

隨后對(duì)MNGCs進(jìn)行了理化組成、宏微觀形貌與力學(xué)性能的分析。FTIR，XRD首先證明了MNGCs中含有PCL和ZnO NPs，Raman不僅證明了MNGCs中含有rGO，且此rGO是被成功還原的。PCL在添加了rGO和ZnO NPs后，由疏水轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水，且親水性較優(yōu)秀，這有利于其生物應(yīng)用。SEM證明了MNGCs中的MNs和微通道具有良好的微觀形貌，而MNGCs的宏觀形貌也與海參高度相似。MNGCs的導(dǎo)管主體部分均具有較好的拉伸性能，能夠穩(wěn)定橋接神經(jīng)而不斷裂；由PG和PZG制成的MNGCs的MNs針尖部分也具有較好的壓縮性能，能夠刺穿并插入肌肉中，為ES的高效傳遞創(chuàng)造條件。

圖四. MNGCs的表征。(A). MNGCs的FTIR圖譜。(B). MNGCs的XRD圖譜。(C). MNGCs的Raman圖譜。(D)和(E). 不同MNGCs的水接觸角照片及其定量分析。(F)和(G). MNGCs的MNs與微通道的SEM照片及其EDS分析。(H).MNGCs的數(shù)碼照片。(I)和(J).MNGCs的導(dǎo)管本體的拉伸試驗(yàn)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線及其楊氏模量。(K)和(I). MNGCs的MNs的壓縮試驗(yàn)的試驗(yàn)力-位移曲線及其位移量為0.75mm時(shí)的試驗(yàn)力。

在體外層面對(duì)MNGCs促進(jìn)PNI修復(fù)的效果進(jìn)行了驗(yàn)證，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)微通道能通過限定SCs的分布來(lái)引導(dǎo)其定向生長(zhǎng)增殖，而ES的促進(jìn)作用和導(dǎo)電微環(huán)境的改善均有利于提升SCs的線性遷移速率，其中ES的促進(jìn)作用更為明顯。上述兩方面的共同作用使得SCs能在MNGCs內(nèi)部高效定向遷移，進(jìn)而促進(jìn)PNI的修復(fù)。

圖五. MNGCs促進(jìn)PNI修復(fù)的體外效果。(A). PG的細(xì)胞毒性。(B). PZG的細(xì)胞毒性。(C). 微通道引導(dǎo)SCs定向生長(zhǎng)的效果。(D). 雙重電學(xué)功能促進(jìn)SCs遷移的效果。

研究團(tuán)隊(duì)建立了大鼠的坐骨神經(jīng)大范圍損傷模型，在體內(nèi)層面對(duì)MNGCs協(xié)同緩解肌肉力量減退和促進(jìn)神經(jīng)再生的效果進(jìn)行了研究。首先研究了MNGCs緩解肌肉力量減退的效果。對(duì)腓腸肌健側(cè)/患側(cè)進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)PZG-MNGCs組的腓腸肌力量減退程度，不論是大體觀察狀態(tài)還是濕重比均接近自體移植治療的效果。Masson染色的結(jié)果，即PZG-MNGCs組的腓腸肌的肌纖維面積最高且膠原纖維面積較低，也印證了這一結(jié)論。因此可以確定，PZG-MNGCs緩解PNI導(dǎo)致的肌肉力量減退的效果優(yōu)異。

圖六. MNGCs緩解肌肉力量減退的體內(nèi)效果。(A). 患側(cè)/健側(cè)腓腸肌大體觀察的照片。(B). 患側(cè)腓腸肌的Masson染色圖片。(C). 患側(cè)/健側(cè)腓腸肌的濕重比。(D). 患側(cè)腓腸肌Masson染色的平均肌纖維面積。(E). 患側(cè)腓腸肌Masson染色的平均膠原纖維面積。

隨后研究了MNGCs促進(jìn)神經(jīng)再生的效果。通過對(duì)新生神經(jīng)進(jìn)行甲苯胺藍(lán)（新生軸突）和勒克索固藍(lán)（新生髓鞘）和CD31-IHC（新生微血管）染色，發(fā)現(xiàn)PZG-MNGCs組的神經(jīng)再生水平接近自體移植治療組。

圖七. MNGCs促進(jìn)神經(jīng)再生的體內(nèi)效果。(A). 新生神經(jīng)的甲苯胺藍(lán)染色圖片。(B). 新生神經(jīng)的勒克索固藍(lán)染色圖片。(C). 新生神經(jīng)的CD31-IHC染色圖片。(D).新生神經(jīng)中活躍SCs的密度。(E). 新生神經(jīng)中髓鞘的密度。(F). 新生神經(jīng)中CD31的密度。

最后研究了MNGCs促進(jìn)神經(jīng)再生的潛在機(jī)制。將NF-200（軸突）和S-100β（髓鞘）作為標(biāo)記為進(jìn)行IF染色，發(fā)現(xiàn)PZG-MNGCs組中NF-200和S-100β的表達(dá)水平接近自體移植治療組。這說明PZG-MNGCs主要依靠施加ES+改善導(dǎo)電微環(huán)境來(lái)促進(jìn)軸突和髓鞘的再生，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)的再生。

圖八. MNGCs促進(jìn)神經(jīng)再生的潛在機(jī)制。(A). 新生神經(jīng)的NF-200的IF染色圖片。(B). 新生神經(jīng)的S-100β的IF染色圖片。(C). 新生神經(jīng)中NF-200的密度。(D). 新生神經(jīng)中S-100β的密度。

綜上所述，具有海參仿生特性的PZG-MNGCs能高效產(chǎn)生并傳導(dǎo)壓電ES，在確保穩(wěn)定橋接缺損神經(jīng)和可以向肌肉傳遞ES的前提下，通過內(nèi)側(cè)的微通道共同促進(jìn)SCs遷移以促進(jìn)神經(jīng)再生，同時(shí)將ES通過MNs傳遞至周圍肌肉，最終在協(xié)同緩解肌肉力量減退和促進(jìn)神經(jīng)再生中取得了相當(dāng)接近自體移植治療這一“金標(biāo)準(zhǔn)"的治療效果。